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| Estándar para Evaluaciones Automáticas |
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Sistema de rutina para evaluaciones de puntos (spots) inmunológicos ligados a actividades de encimas. Enzyme Linked Immuno SPOT – Resultados de gran presición garantizados por la alta resolución
El Procedimiento KS ELISPOT
Las células de los tumores tienen una característica especial. Como otras células, contienen una estructura específica exclusiva de su tipo de célula, llamada antígeno asociado a tumor. Esto la hace diferente de todos los otros cuerpos celulares, y por lo tanto permite su identificación. Tenemos grandes esperanzas de encontrar próximamente un remedio directo donde la identificación es posible.
En la prueba Elispot para TNF-a, Interferon-g, o Interleukin, placas microtiter con membranas de nitrocelulosas están cubiertas con anticuerpos en contra de los citokinos de interés. Después de eso, las placas se llenarán con linfocitos a ser probados y con controles negativos. Las células T en las membranas secretan los citokinos, los cuales se encadenarán a los anticuerpos.
Después de un periodo de incubación, las células se lavarán y el complejo del anticuerpo del citokino se teñirá. De esta forma, las manchas se pueden contar bajo un microscopio.
De esta manera, las manchas generadas por el método Elispot son únicamente una reimpresión de las células generadas originalmente por éste. Algunas de las ventajas son que los especímenes no son peligrosos y estos se pueden guardar por largo tiempo. Además, pueden ser evaluados, ya sea visualmente o mediante el análisis de imágenes y la evaluación se puede repetir con propósitos de control cuando sea necesario.
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| Muestra | Evaluación |
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El espécimen es medido utilizando el sistema KS ELISPOT en un microscopio con iluminación de luz reflejada, equipado con una platina motorizada y una unidad de enfoque automática. Las imágenes de las manchas de citokino se toman con una cámara a color. Siguiendo la digitalización, el software KS ELISPOT procede con el procesamiento automático de datos.
El fácil manejo es esencial para uso de rutina. Se puso especial atención en el diseño de el interfaz del usuario para reducir su participación al mínimo. Se debe realizar una prueba de reconocimiento de todos los parámetros en cada buen posicionamiento utilizando la función "Check Well" (checar placas). Aplicando este procedimiento de enseñanza único, todos los parámetros que influencien el reconocimiento de manchas, se pueden incluir al sistema mediante un solo "click" del mouse en la mancha deseada dentro de la imagen. Dentro de los parámetros disponibles se encuentran el diámetro de la mancha, el color, la saturación de color, el contraste, la forma de la mancha y la irregularidad de su corte.
De la misma manera se pueden eliminar manchas no deseadas de la selección. Todos los índices se pueden almacenar para evaluaciones de rutina.
La ventaja determinante del sistema Cal Zeiss KS ELISPOT en comparación con otros métodos de evaluación, es el incremento directo del valor de los datos científicos. Los resultados son claramente mas reproducibles que los provenientes de una evaluación manual. Finalmente, podemos agregar a lo anterior, disponibilidad de valores de área e intensidad para cada una de las manchas.
Comparado con otros sistemas, podemos mencionar como otra ventaja del sistema KS ELISPOT su alta resolución. Las imágenes se toman con un microscopio Zeiss y como mínimo, se toman 12 imágenes para cada placa. Si se toma una sola imagen por placa, se obtendrá una resolución mucho mas baja al obtener todas manchas del especimen. En experimentos con Interferon-g, el tamaño de la mancha puede bajar a 25 µm de diámetro y en aplicaciones TNF-a, hasta a 15 µm.
Una imagen de 760 x 580 píxeles en un hoyo de la placa únicamente puede resolver el tamaño de un pixel en aproximádamente 12 µm. Esto de ninguna manera es suficiente para la mayoría de las manchas pequeñas, especialmente en el caso de TNF-a. Esto se puede garantizar solamente utilizando una óptica precisa con una buena resolución, dando como resultado en tamaño de pixels entre 2.0 y 2.5 µm, dando por lo menos un diámetro de 6 pixels, hasta de las manchas mas pequeñas.
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